Ett konfokalmikroskop är en speciell typ av fluorescerande mikroskop som används för att erhålla högkvalitativa 2D- och 3D-bilder. Med ett grundläggande (bredfälts) fluorescerande mikroskop lyser ljus av en viss våglängd på ett prov, och provet absorberar en del av det ljuset och reflekterar resten av det vid en längre våglängd. Ljuset med längre våglängd passerar genom en dikroisk spegel, som tillåter ljuset med längre våglängd, men inte det ursprungliga (kortare) våglängdsljuset att passera igenom. Den person som tittar på provet ser bara ljuset som har passerat genom den dikroiska spegeln. Grundläggande fluorescerande mikroskop fångar både i fokus och ur fokus ljus, vilket fungerar bra för stora prover där mycket hög upplösning inte krävs. Det fungerar inte så bra för att se fina detaljer. Ett konfokalmikroskop behövs för att fånga högupplösta fluorescerande bilder.
Det konfokala mikroskopet använder ett nålhål för att avvisa oskarpt ljus. Istället för att ljus bara passerar genom en dikroisk spegel, passerar ljus genom både en dikroisk spegel och ett nålhål, vilket innebär att personen som tittar på provet bara ser en enda punkt av provet. För att se ett helt prov skannar rörliga speglar ljus över ett rektangulärt plan av provet, och en dator samlar upp det emitterade ljuset när provet skannas. En fullständig skanning kommer att resultera i en optisk skiva, eller ett tvärsnitt, av provet. Denna typ av mikroskopi kallas konfokal laserskanningsmikroskopi, delvis för att en laser används som ljuskälla.
För att skapa en 3D-bild görs flera skanningar, skapar flera ”skivor” av provet, och en dator kombinerar varje skiva för att skapa en tredimensionell bild. Mikroskopet kan programmeras för att variera utrymmet mellan skivor, beroende på hur skarp en 3D-bild användaren vill få. Mikroskopet kan också variera hastigheten med vilken det skannar en bild, med långsam skanning som ger högre upplösning än snabb skanning.
Det konfokala mikroskopet har blivit en mycket vanlig utrustning i många biovetenskapslaboratorier. De är dyra, och något stora, och har ofta rum som är dedikerade till deras användning, eftersom rummet måste vara mörkt för att få en bra fluorescerande bild. Även om konfokalmikroskop oftast används för att se celler och strukturer i celler, kan de användas för att få en bild av vilket tredimensionellt fluorescerande prov som helst, och de används ibland för att se halvledarmaterial.