Protein dibangun dari rantai asam amino, yang masing-masing memiliki nilai pH yang berbeda. PH keseluruhan protein terdiri dari campuran nilai-nilai pH asam amino individu saat mereka membentuk ion dalam larutan tertentu di mana mereka dilarutkan. Titik isoelektrik (pI) protein adalah pH di mana protein tersebut tidak memiliki muatan bersih. Sifat ini dapat dimanfaatkan untuk memisahkan protein dengan pI yang diketahui dari protein lain dalam campuran heterogen.
Asam amino memiliki gugus terminal amino yang bersifat basa, memiliki pH tinggi. Ujung asam amino yang lain adalah terminal karboksil yang bersifat asam, dengan pH rendah. Pada nilai pH yang berbeda, asam amino pada protein akan bervariasi dalam muatannya. Protein di bawah titik isoelektriknya memiliki muatan positif. Sebaliknya, mereka yang berada di atas titik ini memiliki muatan negatif.
Untuk memanfaatkan pengetahuan tentang titik isoelektrik untuk pemurnian protein, campuran protein dikenai medan listrik. Ini biasanya dilakukan dalam gel agarosa atau poliakrilamida, dan dikenal sebagai pemfokusan isoelektrik. Teknik yang lebih tua adalah untuk melakukan prosedur pada skala yang lebih besar dalam kolom kaca menggunakan larutan sukrosa dengan elektroda di setiap ujungnya. Senyawa yang disebut amfolit ditambahkan yang menyebabkan pembentukan gradien pH yang konsisten. Ketika gel atau kolom dikenai arus listrik, protein bermigrasi sampai mencapai titik isoelektriknya, dan kemudian tetap diam.
Protein pada gel umumnya dibuat terlihat oleh pewarna yang mengikat protein. Kadang-kadang, jika enzim sedang dipelajari, substrat dapat digunakan yang memberikan reaksi berwarna. Biasanya digunakan standar yang memiliki protein dengan titik isoelektrik yang diketahui.
Setelah seseorang mengetahui di mana protein yang diinginkan berada, teknik yang umum adalah memotong protein yang diisolasi dari gel. Protein kemudian dapat dimurnikan dan diurutkan. Setelah urutan diketahui, dapat digunakan untuk merancang primer untuk reaksi berantai polimerase (PCR) dan digunakan untuk mengkloning gen untuk protein jika bahan asam nukleat yang sesuai tersedia.
Pemfokusan isoelektrik juga merupakan cara umum untuk menganalisis protein yang terkait erat untuk melihat betapa berbedanya mereka satu sama lain. Salah satu komplikasinya adalah protein dapat memiliki gula yang terikat padanya. Ini disebut glikosilasi dan dapat mempengaruhi pI protein. Ini mungkin terlihat seperti ada banyak protein dengan titik isoelektrik yang berbeda, padahal sebenarnya hanya ada satu protein yang telah terglikosilasi secara berbeda. Protein yang dimurnikan dengan metode standar seperti kromatografi terkadang dianalisis dengan pemfokusan isoelektrik untuk memastikan kemurniannya.