Koloni yang hilang, yang juga dikenal sebagai Roanoke, adalah impian Sir Walter Raleigh. Pada bulan Maret 1584, Raleigh telah menerima hibah dari Ratu Elizabeth yang memungkinkan dia untuk menjelajahi daerah kafir di dunia baru dengan imbalan seperlima dari harta apa pun yang ditemukan. Koloni ini merupakan upaya pertama di pemukiman kolonial. Raleigh harus memusatkan aktivitasnya jauh dari dominasi Spanyol di garis pantai Amerika, yang sejauh utara Florida. Dia juga harus mengemudi ke selatan Newfoundland, yang dipenuhi kabut dan orang-orang Indian yang bermusuhan.
Kapten Arthur Barlowe dan sekitar seratus orang Inggris yang dikirim ke Dunia Baru atas nama Sir Walter Raleigh, tiba di Pulau Roanoke yang subur dan harum, yang dinamai Virginia, pada hari musim panas yang cerah pada tahun 1585. Dilindungi oleh bukit pasir ramping yang akan kemudian dikenal sebagai Outer Banks, koloni yang hilang menawarkan janji dan harapan akan awal yang baru. Nasib anak kulit putih pertama yang lahir di dunia baru, Virginia Dare, serta semua penghuni koloni lainnya, tetap menjadi misteri hingga hari ini.
Penduduk asli koloni yang hilang itu ramah dan membantu para pemukim awal, di antaranya seorang ilmuwan brilian bernama Thomas Hariot, yang mendirikan laboratorium sains pertama di Dunia Baru, dan seorang seniman bernama John White. Segalanya berjalan dengan baik sampai Sir Ralph Lane, komandan koloni, membuat marah orang-orang Indian dengan kebijakannya yang keras. Pada musim panas 1586, Sir Francis Drake tiba di Roanoke dalam perjalanan ke Inggris dari Hindia Barat. Makanan dan persediaan langka karena kapal dari negara induk belum tiba, dan semua kecuali lima belas penjajah memilih untuk kembali bersama Drake.
Kapal suplai yang dikomandoi oleh Sir Richard Grenville, tiba di koloni yang hilang tak lama setelah Drake meninggalkan pulau, tetapi yang mereka temukan hanyalah pemukiman sepi tanpa jejak siapa pun di mana pun. Tahun berikutnya, pada bulan Agustus 1587, Raleigh mengirim John White bersama 115 pria, wanita, dan anak-anak dalam upaya kedua untuk menyelesaikan koloni Pulau Roanoke. Kolonis membangun kembali sisa-sisa bekas pemukiman yang hangus dan John White menjadi gubernur baru. Keluarganya, termasuk cucunya yang baru lahir, Virginia Dare, menunggu kepulangannya dari Inggris dengan lebih banyak persediaan, tetapi ia tertunda karena perang antara Inggris dan Spanyol.
Pada Agustus 1590, John White kembali ke Roanoke tetapi tidak ada apa-apa di sana. Satu-satunya petunjuk adalah kata misterius “Kroasia” yang diukir di pohon, yang mungkin merujuk pada suku Indian ramah yang tinggal di selatan koloni yang hilang. Beberapa mengatakan orang India membunuh para pemukim, sementara yang lain mengklaim mereka pindah lebih jauh ke pedalaman dan akhirnya menikah dengan suku asli Amerika. Masih teori ketiga menegaskan bahwa menyerang pasukan Spanyol dari Florida membunuh penjajah.