Western blot-protokollet är den exakta standarden enligt vilken immunoblottestet utförs. Western blot används för att detektera proteiner i ett vävnadsprov. Processen separerar naturliga proteiner genom att bestämma längderna av polypeptider med hjälp av en gelelektrofores. Proteinerna själva överförs sedan till ett nitrocellulosamembran och sonderas av antikroppar.
Den första delen av Western blot-protokollet börjar med vävnadsinsamling. Dessa prover tas antingen från levande vävnad eller från en cellkultur. Vävnad bryts ner och olika inhibitorer som proteas eller fosfatas introduceras för att hindra enzymer från att utföra matsmältning. Denna del av protokollet hanteras vanligtvis i kalla temperaturer för att bevara vävnaderna.
Gelelektroforesprocessen är nästa steg i Western blot-protokollet. I denna del identifieras proteinerna av olika faktorer såsom molekylvikt eller elektrisk laddning. Denna process slutförs oftast med användning av polyakrylamidgeler med en buffert av natriumdodecylsulfat. I grund och botten blir proteinerna negativt laddade och rör sig mot en positivt laddad elektrod i gelén.
Överföring av proteinerna är nästa del av den övergripande Western blot-processen. Ett membran placeras ovanpå gelén, följt av filterpapper. När en elektrisk ström administreras dras proteiner in i membranet. Detta kallas den faktiska ”blotting”-delen av analysen. Membranen är mycket ömtåliga och lätt mottagliga för skador.
Det korrekta flödet av western blot-protokollet kräver steget som kallas bindning. För att förhindra kontaminering av själva proteinerna av de antikroppar som måste tillsättas, måste en sorts avskärmning implementeras. Den vanligaste typen av blockering använder fettfri torrmjölk och ett rengöringsmedel. Detta binder till de öppna fläckarna i membranet och möjliggör tydligare resultat när antikroppen tillsätts.
Detektion är nästa steg enligt korrekt protokoll. Proteinerna introduceras till antikroppar som har kopplats till ett specifikt enzym som ska ge forskarna den önskade informationen. Antikroppen inkuberas med membranet i 30 minuter eller mer. Därefter tvättas membranet och en sekundär antikropp introduceras som binder till den första. Ofta används ett självlysande medel för att hjälpa forskare med identifieringsprocessen.
Materialet tvättas igen för att ta bort eventuella obundna föremål. Analys av storleken på de färgade banden avslöjar information om prominensen och omfattningen av ett specifikt protein. Detta görs vanligtvis några gånger för att säkerställa korrekt analys. Alternativ för upptäckt inkluderar röntgenstrålar, färgning och kemikalier.