Vad är proteinutfällning?

Proteinfällning är en metod som används för att extrahera och rena proteiner som hålls i en lösning. Stora, komplexa molekyler, proteiner har i allmänhet delar som har en negativ elektrisk laddning och delar som har en positiv laddning, såväl som hydrofila och hydrofoba delar. Det finns en tendens för proteiner i lösning att klumpa ihop sig och fällas ut på grund av attraktionen mellan de negativt och positivt laddade delarna av molekylerna och den ömsesidiga attraktionen av de hydrofoba delarna. Att motverka denna tendens är dock det faktum att i en vattenlösning kommer vattenmolekyler, som är polära, att tendera att ordna sig runt proteinmolekylerna på grund av den elektrostatiska attraktionen mellan motsatt laddade delar av vattnet och proteinmolekylerna. Detta resulterar i att proteinmolekylerna hålls isär och förblir i lösning, men det finns olika metoder för att åstadkomma utfällning av proteiner.

Den vanligaste metoden för proteinfällning är att tillsätta en lösning av ett salt, en teknik som ofta kallas ”utsaltning”. Det salt som används oftast är ammoniumsulfat. Interaktionen mellan saltjonerna och vattenmolekylerna tar bort vattenbarriären mellan proteinmolekylerna, vilket gör att de hydrofoba delarna av proteinet kan komma i kontakt. Detta resulterar i att proteinmolekylerna aggregeras och fälls ut ur lösningen. Som en allmän regel gäller att ju högre molekylvikt proteinet har, desto lägre koncentration av saltet som krävs för att orsaka utfällning, så det är möjligt att separera en blandning av olika proteiner i lösning genom att gradvis öka saltkoncentrationen, så att olika proteiner fälls ut i olika stadier, en process som kallas fraktionerad utfällning.

Lösligheten av ett protein i ett vattenhaltigt medium kan reduceras genom att införa ett organiskt lösningsmedel. Detta har som effekt att reducera dielektricitetskonstanten, vilket i detta sammanhang kan ses som ett mått på ett lösningsmedels polaritet. En minskning av polariteten betyder att det finns mindre tendens för lösningsmedelsmolekyler att klunga sig runt proteinets molekyler, så att det blir mindre vattenbarriär mellan proteinmolekyler och en större tendens till proteinutfällning. Många organiska lösningsmedel interagerar med de hydrofoba delarna av proteinmolekyler, vilket orsakar denaturering; men vissa, såsom etanol och dimetylsulfoxid (DMSO), gör det inte.

Även om proteiner kan ha negativt och positivt laddade delar, ofta i lösning, kommer de att ha en övergripande positiv eller negativ laddning som varierar beroende på pH, och håller dem isär genom elektrostatisk repulsion. Under sura förhållanden, med ett lågt pH, tenderar proteiner att ha en övergripande positiv laddning, medan vid högt pH är laddningen negativ. Proteiner har en mellanliggande punkt där det inte finns någon total laddning – detta kallas den isoelektriska punkten och för de flesta proteiner ligger den i pH-intervallet 4-6. Den isoelektriska punkten för ett löst protein kan uppnås genom att tillsätta en syra, vanligtvis saltsyra eller svavelsyra, för att sänka pH till lämplig nivå, vilket möjliggör klustring och utfällning av proteinmolekylerna. En nackdel med denna metod är att syrorna tenderar att denaturera proteinet, men det används ofta för att ta bort oönskade proteiner.

Andra metoder för proteinfällning inkluderar nonjoniska hydrofila polymerer och metalljoner. De förra minskar mängden vatten tillgängligt för att bilda en barriär mellan proteinmolekyler, vilket gör att de kan klumpa ihop sig och fällas ut. Positivt laddade metalljoner kan binda till negativt laddade delar av proteinmolekylen, vilket minskar proteinets tendens att attrahera ett lager av vattenmolekyler runt det, vilket återigen tillåter proteinmolekylerna att interagera med varandra och fällas ut ur lösningen. Metalljoner är effektiva även i mycket utspädda lösningar.