Bisulfitsekvensering är en metod där olika regioner av DNA analyseras med hjälp av metylering. Metylering är processen att lägga till en specifik molekyl, kallad en metylgrupp, till en nukleotid, i det här fallet vanligtvis ett cytosin. Inaktiva nukleotider är ofta metylerade, så denna metod kan användas för en mängd olika ändamål, från att bestämma aktiva regioner i ett genom till att identifiera genrika regioner. Vid bisulfitsekvensering påverkas inte metylerade cytosiner av sekvenseringsprocessen, medan icke-metylerade cytosiner omvandlas till uracil, en nukleotid som vanligtvis inte finns i det genetiska materialet, deoxiribonukleinsyra (DNA.)
Denna metod är mycket känslig för förändringar i metylering, så små förändringar i bindning kan ge forskare specifik information om specifika nukleotider. Natriumbisulfit omvandlar cytosin till uracil, men omvandlingen sker i en miljö där metylerat cytosin inte kommer att genomgå denna förändring. När bisulfitsekvenseringen är klar har det ursprungliga DNA:t omvandlats till en väsentligt annorlunda molekyl. Cytosiner kommer att vara mycket utarmade eller potentiellt frånvarande. Om ett cytosin fortfarande finns i denna omvandlade molekyl, representerar det ett naturligt metylerat cytosin i genomet under övervägande.
Liksom alla experimentella protokoll har bisulfitsekvensering nackdelar. Dess största nackdel är att den kräver en mycket hög saltkoncentration för att fungera korrekt. Saltet uppmuntrar hybridisering av enkelsträngat DNA till dess mer naturliga dubbelhelix, och natriumbisulfiten kan inte alltid nå cytosiner när de ingår i dubbelsträngat DNA. Om saltkoncentrationen är för hög kan det hända att ett antal cytosiner inte omvandlas till uracil, vilket resulterar i falsk identifiering av metylerade cytosiner i ett genom. Denatureringsmedel kan vara nödvändiga för att minimera antalet falska positiva identifieringar.
Stora mängder genomisk data är inte nödvändiga för bisulfitsekvensering, så metoden har en användbar tillämpning för att analysera kliniska prover. Den ursprungliga nukleinsyrakällan spelar ingen roll, men källan måste vara DNA. I teorin kan ribonukleinsyra (RNA) sekvenseras med denna metod, eftersom de flesta RNA är enkelsträngade och inte skulle vara lika mottagliga för falska positiva på grund av blockerade nukleotider. När den omsätts i praktiken är dock bisulfitsekvensering inte användbar för RNA, eftersom RNA naturligt har uracil i sig. Utan någon form av extern markering eller tillägg till protokollet skulle omvandlade cytosiner inte kunna skiljas från naturlig uracil.
När man utför någon typ av sekvenseringsmetoder är noggrannhet och precision avgörande. Känsliga metoder som bisulfitsekvensering erbjuder ett pålitligt sätt för sekvensanalys, vilket i sin tur möjliggör genanalys och identifiering av mål för läkemedel och terapier. Även om denna metod inte kan användas på levande människor, kan den fortfarande vara till stor hjälp med endast de minsta vävnadsprover att arbeta med.