Agarosgel är ett ämne som används inom biokemi och bioteknik för gelelektrofores och storleksexklusionskromatografi, vilket är metoder för att sortera stora molekyler efter deras storlek och elektriska laddning. Dessa processer använder agaros för att separera och analysera proteiner och DNA. Den är mycket lämplig för dessa applikationer på grund av dess molekylära struktur, som gör att molekyler av olika storlek kan röra sig genom den i olika hastigheter. Materialet erhålls från olika typer av tång, och finns vanligtvis i laboratorier i pulverform. För att göra ett lämpligt medium för ett givet test tillsätts pulvret till vatten i lämplig koncentration, kokas och får sedan svalna till en gel.
Tillverkning
Agaros utvinns i form av agar från flera arter av röda marina alger, eller tång, som finns i Kalifornien och östra Asien. Agar, en term som kommer från det malaysiska ordet agar-agar, som betyder gelé, erhålls vanligtvis från Gelidium-typerna av tång. Den är sammansatt av två olika ämnen, kända som agaros och agaropektin, och ger stöd till cellväggarna i de marina algerna. När den tas bort kan agaren användas som matförtjockningsmedel, ungefär som gelatin, eller som laxermedel. Om det är renat kan det användas som ett medium för att odla bakterier, svampar eller andra mikroorganismer.
Det är ganska lätt att separera agaros från agaropektin i agar eftersom agarosmolekylerna binder starkt till varandra, medan agaropektinet gelar dåligt. Det finns flera metoder för att uppnå isolering av agaros. I en metod tillsätts karragenan, en annan molekyl som finns i röd tång, och ett salt till agaren. Detta gör att agaropektinet fälls ut eller bildar ett fast ämne som kan avlägsnas från agarlösningen. En annan metod lägger till enzymet pektinas, en kemikalie som bryter ner agaropektinet, vilket gör att det kan lösas upp i vatten.
Gelelektrofores
Agarosgel är oftast förknippad med elektrofores. I denna procedur applicerar forskare ett elektriskt fält över en platta av materialet som innehåller löst DNA, RNA eller proteinfragment. Detta får dessa stora molekyler att röra sig på grund av deras elektriska laddningar: positivt laddade typer kommer att röra sig mot den negativa sidan, och vice versa. DNA- och RNA-fragment har en negativ laddning och kommer därför att röra sig mot den positiva änden, medan proteinfragment kan vara antingen negativa eller positiva.
Den hastighet med vilken molekylerna rör sig beror på deras storlek och på hur mycket laddning de har. Agarosgel är strukturerad på ett sådant sätt att den bildar ett slags nät, med hål genom vilka andra molekyler kan färdas. Det är lättare för mindre att gå igenom hålen, och så reser de snabbare. Bland större molekyler spelar också formen in, genom att de mer kompakta med går igenom lättare. Tekniken används både för att analysera prover och för att isolera särskilda DNA-sekvenser för användning i biotekniska tillämpningar.
Före elektrofores skulle ett DNA-prov behandlas med speciella enzymer som skär de långa, strängliknande molekylerna på specifika ställen, vilket gör mindre fragment. Agarosgelen framställs genom att lösa upp pulvret i en buffertlösning, som motstår förändringar av pH – surhet/alkalinitet – som annars skulle kunna bero på elektrokemiska effekter. Olika mängder pulver används för olika molekylområden, men vanligtvis är koncentrationen mellan 0.7 och 1.2 %. Ett fluorescerande färgämne som kallas etidiumbromid tillsätts vanligtvis vid denna tidpunkt, eftersom det färgar DNA och gör det lätt synligt under ultraviolett ljus. Denna blandning förbereds sedan i mikrovågsugn och får stelna.
DNA-proverna placeras i små brunnar i gelén och en elektrisk likström appliceras över den. Olika stora molekyler färdas över gelén med olika hastighet, så efter en viss tid kommer de att dyka upp på olika positioner, med de mindre fragmenten längre mot den positiva änden. Detta gör det möjligt för forskare att bestämma storleken på fragmenten och att isolera olika DNA-sekvenser.
andra användningsområden
Agarosgel används ibland i en relaterad teknik som inte involverar elektricitet, känd som storleksexklusionskromatografi. I denna metod packas en glaskolonn med pärlor gjorda av gel, och en lösning innehållande molekyler av olika storlek hälls i. I motsats till elektrofores rör sig de större molekylerna snabbare ner i kolonnen för att komma ut i botten, medan fortskridandet av mindre bromsas i pärlorna. Detta beror på att de små molekylerna tenderar att absorberas i porerna i gelén, medan de större är för stora för att komma in i dessa porer och istället tenderar att flyta mellan pärlorna. Geltypen och koncentrationen kan justeras för att passa storleken på den molekyl som ska separeras.