Absorbansi spektrofotometer mengacu pada jumlah cahaya yang diserap oleh larutan, yang diukur dengan instrumen laboratorium yang disebut spektrofotometer absorbansi. Dalam kimia dan biologi, spektrofotometer digunakan untuk berbagai tujuan. Mereka dapat membantu mengidentifikasi senyawa, menentukan konsentrasi larutan, atau memperkirakan jumlah sel yang tersuspensi dalam cairan. Spektrofotometer bekerja dengan mengarahkan serangkaian panjang gelombang cahaya tertentu yang disaring melalui larutan sampel dan ke pengukur cahaya. Jumlah cahaya yang ditransmisikan atau diserap oleh sampel, serta panjang gelombang yang diserap, mengungkapkan beberapa sifat sampel.
Cahaya yang dirasakan manusia secara visual adalah bentuk energi, radiasi elektromagnetik, dan mencakup rentang panjang gelombang pada sebagian kecil spektrum elektromagnetik. Sinar gamma, sinar-X, dan panjang gelombang pendek lainnya di bawah 400 nanometer (nm) tidak terlihat oleh mata manusia, dan panjang gelombang juga tidak lebih dari 700 nm, seperti cahaya inframerah atau gelombang radio. Warna yang dirasakan manusia berkisar dari gelombang biru dan ungu yang lebih pendek sekitar 400 nm melalui pelangi hingga merah, yang lebih dekat ke 700 nm. Spektrofotometer mengukur dalam rentang yang terlihat dengan beberapa tumpang tindih ke dalam bagian spektrum ultraviolet dan inframerah.
Ketika kita melihat warna, misalnya daun hijau, kita melihat panjang gelombang cahaya yang ditransmisikan oleh item itu. Dalam kasus daun hijau, senyawa dalam sel tumbuhan yang disebut klorofil menyerap panjang gelombang biru dan merah dari cahaya putih matahari, tetapi tidak menyerap hijau dengan kuat. Sebaliknya, panjang gelombang hijau dan hijau dekat sedang ditransmisikan, dan tanaman tampak hijau.
Dalam larutan cair apa pun, beberapa panjang gelombang cahaya akan diserap dalam jumlah yang lebih besar daripada yang lain. Spektrofotometer mengarahkan seberkas cahaya putih melalui larutan sampel yang sedang dipelajari. Spektrofotometer absorbansi adalah jumlah cahaya yang diserap oleh senyawa yang diteliti. Cahaya ini diserap dalam jumlah yang bervariasi di berbagai panjang gelombang yang dikenal sebagai spektrum penyerapan.
Spektrum serapan dapat membantu untuk mengidentifikasi senyawa sampel. Misalnya, beberapa pigmen tumbuhan menyerap panjang gelombang yang berbeda dari klorofil dan dapat dibedakan satu sama lain dengan plot penyerapannya — grafik di mana absorbansi spektrofotometer ditampilkan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Panjang gelombang yang diserap dalam jumlah tertinggi akan muncul sebagai paku pada grafik, memberikan grafik masing-masing senyawa bentuk karakteristik.
Konsentrasi larutan juga dapat disimpulkan dari absorbansi spektrofotometernya. Hal ini dilakukan melalui hukum Lambert-Beer, juga dikenal sebagai hukum Beer, yang merupakan persamaan yang menghubungkan tingkat absorbansi spektrofotometer dengan konsentrasi melalui dua faktor lain: koefisien pemadaman dan panjang lintasan, atau lebar tabung sampel. Koefisien kepunahan adalah faktor kimia yang berbeda untuk setiap senyawa, tetapi dapat ditentukan dengan menguji sampel yang diketahui konsentrasinya di spektrofotometer. Hukum Beer kemudian dapat digunakan untuk memecahkan konsentrasi yang tidak diketahui dari senyawa yang sama.