Spektrofotometer adalah salah satu instrumen ilmiah yang biasa ditemukan di banyak penelitian dan laboratorium industri. Spektrofotometer digunakan untuk penelitian di laboratorium fisika, biologi molekuler, kimia, dan biokimia. Biasanya, namanya mengacu pada Spektroskopi Ultraviolet-Visible (UV-Vis).
Energi cahaya tergantung pada panjang gelombangnya, biasanya disebut lambda. Meskipun spektrum elektromagnetik meluas pada rentang panjang gelombang yang luar biasa, sebagian besar laboratorium hanya dapat mengukur sebagian kecil dari mereka. Spektroskopi UV-Vis mengukur antara 200 dan 400 nanometer (nm) untuk pengukuran sinar UV, dan hingga sekitar 750 nm dalam spektrum tampak.
Untuk Spektroskopi UV-Vis, sampel biasanya disimpan dan diukur dalam wadah kecil yang disebut kuvet. Ini dapat berupa plastik jika digunakan dalam spektrum yang terlihat, tetapi harus berupa kuarsa atau silika yang menyatu jika digunakan untuk pengukuran UV. Ada beberapa mesin yang dapat menggunakan tabung reaksi kaca.
Spektroskopi Terlihat sering digunakan secara industri untuk kolorimetri. Dengan menggunakan metode ini, sampel diukur pada beberapa panjang gelombang dari 400-700 nm, dan profil absorbansinya dibandingkan dengan standar. Teknik ini sering digunakan oleh produsen tekstil dan tinta. Pengguna komersial lain dari Spektroskopi UV-Vis termasuk laboratorium forensik dan printer.
Dalam penelitian biologi dan kimia, larutan sering diukur dengan mengukur tingkat penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu. Nilai yang disebut koefisien kepunahan digunakan untuk menghitung konsentrasi senyawa. Misalnya, laboratorium biologi molekuler menggunakan spektrofotometer untuk mengukur konsentrasi sampel DNA atau RNA. Mereka terkadang memiliki mesin canggih yang disebut spektrofotometer NanoDrop™ yang menggunakan sebagian kecil dari jumlah sampel dibandingkan dengan yang digunakan oleh spektrofotometer tradisional.
Agar kuantifikasi valid, sampel harus mematuhi Hukum Beer-Lambert. Ini mensyaratkan bahwa absorbansi berbanding lurus dengan panjang lintasan kuvet dan penyerapan senyawa. Ada tabel koefisien kepunahan yang tersedia untuk banyak, tetapi tidak semua, senyawa.
Banyak reaksi kimia dan enzimatik berubah warna dari waktu ke waktu, dan spektrofotometer sangat berguna untuk mengukur perubahan ini. Misalnya, enzim polifenol oksidase yang menyebabkan buah menjadi coklat mengoksidasi larutan senyawa fenolik, mengubah larutan bening menjadi larutan yang terlihat berwarna. Reaksi tersebut dapat diuji dengan mengukur peningkatan absorbansi sebagai perubahan warna. Idealnya, laju perubahan akan linier, dan seseorang dapat menghitung laju dari data ini. Spektrofotometer yang lebih maju akan memiliki tempat kuvet yang dikontrol suhu untuk melakukan reaksi pada suhu ideal yang tepat untuk enzim.
Laboratorium mikrobiologi dan biologi molekuler sering menggunakan spektrofotometer untuk mengukur pertumbuhan kultur bakteri. Eksperimen kloning DNA sering dilakukan pada bakteri, dan peneliti perlu mengukur tahap pertumbuhan kultur untuk mengetahui kapan harus melakukan prosedur tertentu. Mereka mengukur absorbansi, yang dikenal sebagai optical density (OD), pada spektrofotometer. Seseorang dapat mengetahui dari OD apakah bakteri tersebut aktif membelah atau apakah mereka mulai mati.
Spektrofotometer menggunakan sumber cahaya untuk menyinari serangkaian panjang gelombang melalui monokromator. Perangkat ini kemudian mentransmisikan pita cahaya yang sempit, dan spektrofotometer membandingkan intensitas cahaya yang melewati sampel dengan yang melewati senyawa referensi. Misalnya, jika suatu senyawa dilarutkan dalam etanol, referensinya adalah etanol. Hasilnya ditampilkan sebagai tingkat absorbansi dari perbedaan di antara keduanya. Hal ini menunjukkan absorbansi senyawa sampel.
Alasan untuk absorbansi ini adalah bahwa sinar ultraviolet dan sinar tampak memiliki energi yang cukup untuk mengeksitasi bahan kimia ke tingkat energi yang lebih besar. Eksitasi ini menghasilkan panjang gelombang yang lebih tinggi, yang terlihat ketika absorbansi diplot terhadap panjang gelombang. Molekul yang berbeda atau senyawa anorganik menyerap energi pada panjang gelombang yang berbeda. Mereka dengan daya serap maksimum dalam rentang yang terlihat terlihat berwarna oleh mata manusia.
Solusi senyawa bisa jernih, tetapi menyerap dalam kisaran UV. Senyawa tersebut biasanya memiliki ikatan rangkap atau cincin aromatik. Kadang-kadang ada satu atau lebih puncak yang dapat dideteksi ketika tingkat penyerapan diplot terhadap panjang gelombang. Jika demikian, ini dapat membantu dalam identifikasi beberapa senyawa dengan membandingkan bentuk plot dengan plot referensi yang diketahui.
Ada dua jenis mesin spektrofotometer UV-Vis, single-beam dan double-beam. Ini berbeda dalam cara mereka mengukur intensitas cahaya antara referensi dan sampel uji. Mesin balok ganda mengukur senyawa referensi dan uji secara bersamaan, sedangkan mesin balok tunggal mengukur sebelum dan sesudah senyawa uji ditambahkan.