Perpustakaan gen adalah istilah untuk kumpulan fragmen asam deoksiribonukleat (DNA) yang telah dikloning secara acak dari genom organisme. Mereka dikloning sebagai plasmid yang dapat bereplikasi secara terpisah dari kromosom dan fag mereka, yang merupakan virus parasit yang memakan bakteri. Ketika dikloning sebagai plasmid, koleksinya adalah sel inang dan masing-masing sel berisi fragmen DNA. Pustaka gen fag terdiri dari apa yang disebut lisat fag, yang merupakan residu sel yang dihancurkan dengan fragmen DNA yang disisipkan. Ketika perpustakaan gen berisi kumpulan semua informasi genetik pada suatu organisme, mereka dianggap sebagai perpustakaan gen representasional.
Selain itu, perpustakaan dapat menggunakan asam nukleat rekombinan seluler (RNA) untuk bahan berlabuh, dan kumpulan sel inang dengan vektor rekombinan ini dikenal sebagai perpustakaan gen cRNA. Skrining perpustakaan gen menemukan sel-sel tertentu yang mengandung vektor kloning dengan gen tertentu sedang dicari di perpustakaan gen dan kemudian menggunakan salah satu dari banyak teknik mengisolasi dan memanennya. Setelah dipanen, sel dianggap kloning. Agar memiliki peluang yang masuk akal untuk mengisolasi dan mengkloning gen tertentu, biasanya hanya perpustakaan gen representasional yang digunakan karena setiap gen dan setiap fragmen DNA asli dari genom tertentu dikumpulkan di dalamnya. Untuk mencapai peluang 99% menemukan gen manusia tertentu untuk kloning, lebih dari 600,000 sel kloning perlu disaring untuk menemukan gen yang diinginkan dari perpustakaan gen representasional.
DNA diekstraksi dari suatu organisme untuk memulai perpustakaan gen. Perpustakaan ini disusun untuk mengatur DNA dan ribuan gen yang berbeda. Perpustakaan menjadi kumpulan dari puluhan ribu koloni bakteri, masing-masing dimodulasi dengan fragmen DNA dari organisme yang mengandung gen minat khusus. Perpustakaan juga mengandung enzim restriksi dan plasmid. Enzim restriksi digunakan untuk membaca informasi nukleotida DNA dan digunakan untuk memotong DNA menjadi fragmen dengan memisahkan nukleotida satu sama lain.
Enzim restriksi yang sama memotong plasmid bakteri dan fragmen dan plasmid digabungkan dalam tabung reaksi untuk digabungkan, membuat kombinasi baru. Plasmid rekombinan ini kemudian dikembalikan ke kultur bakteri baik menggunakan kejutan panas atau elektroporasi. Langkah-langkah ini dilakukan berulang-ulang sampai seluruh perpustakaan gen telah dibentuk untuk organisme genom tertentu dari semua fragmen ekstraksi DNA asli.