Tingkat fosforilasi molekul atau zat organik ditentukan dengan dua metode: western blotting dan spektrometri massa. Fosforilasi paling sering mengacu pada perlekatan fosfat ke protein. Ketika fosfat menempel pada protein, proses alami dan fungsi enzim protein dalam tubuh manusia terganggu. Menentukan tingkat fosforilasi sangat penting untuk mengobati berbagai macam penyakit, dari kanker hingga diabetes.
Western blotting adalah metode populer yang digunakan untuk menentukan tingkat fosforilasi dari kumpulan protein tertentu. Antibodi seperti antibodi monoklonal anti-fosfo-tirosin biasanya digunakan karena mereka mudah mengikat residu tirosin protein, yang dipengaruhi oleh fosforilasi. Di western blotting, protein pertama-tama dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan metode muatan listrik yang dikenal sebagai elektroforesis gel.
Protein kemudian ditransfer ke membran yang telah dilapisi dengan antibodi khusus yang mengikat fosfat pada protein. Setelah protein ditransfer, antibodi akan menempel pada protein apa pun dengan fosfat yang melekat. Tingkat fosforilasi kemudian dapat ditentukan dengan sinar-x membran. Setiap protein yang terpengaruh akan mengeluarkan kilatan cahaya, sehingga memudahkan peneliti untuk mengukur tingkat fosforilasi.
Spektrometri massa adalah cara lain untuk mengukur tingkat fosforilasi suatu zat. Proses ini mengubah molekul protein menjadi ion, yang membuatnya lebih mudah dilacak dan diukur. Sampel terionisasi oleh sumber ion bertenaga tinggi yang membanjiri sampel dengan elektron. Tindakan ini mengubah sampel menjadi kation, ion bermuatan positif.
Penganalisis massa dari spektrometer massa memisahkan ion berdasarkan massa dan intensitas muatannya. Hal ini memungkinkan peneliti untuk menemukan rasio massa-untuk-muatan, yang sangat penting dalam menemukan tingkat fosforilasi sampel. Terakhir, detektor mengukur ion agar data dapat ditampilkan dalam bentuk grafik. Bagan menunjukkan rasio massa terhadap muatan ion pada sumbu x, dan intensitas relatif ion pada sumbu y.
Tingkat fosforilasi juga dapat diukur selama fosforilasi substrat. Fosforilasi substrat adalah proses yang menciptakan adenosin trifosfat (ATP), molekul penting untuk transfer energi antar sel, selama glikolisis. Proses ini terjadi baik pada sel hewan maupun sel tumbuhan.
Dalam sel tumbuhan, molekul ATP dibuat dengan menggunakan energi dari matahari. Energi ini memacu fosforilasi dalam kloroplas tumbuhan, tempat fotosintesis tumbuhan. Tingkat fosforilasi berkorelasi dengan jumlah fosfat yang dibutuhkan untuk membuat molekul ATP tambahan.