Enzim dan substrat terkait dalam dua cara utama karena mereka sering berinteraksi satu sama lain dalam banyak proses biologis. Pertama, enzim dan substrat seringkali spesifik satu sama lain, memiliki bentuk komplementer yang memungkinkan mereka untuk mengikat. Kedua, enzim dapat mengubah substrat dengan mengkatalisis reaksi kimia atau memodifikasi struktur. Bersama-sama mereka menjalani transformasi, termasuk kompleks enzim substrat (ES), keadaan antara, dan keadaan transisi.
Diperkirakan ada sekitar 75,000 enzim dalam tubuh manusia, banyak di antaranya khusus untuk substrat tertentu. Enzim dan substrat berikatan satu sama lain berasosiasi melalui berbagai interaksi, termasuk ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan ikatan kovalen. Pengikatan awal ini disebut sebagai model kecocokan yang diinduksi, daripada model kunci-dan-kunci, karena setiap molekul berubah sebagai respons terhadap pengikatan dengan molekul lain untuk membentuk bentuk tiga dimensi baru. Bersama-sama, enzim dan substrat membentuk kompleks ES, di mana reaksi kimia dapat terjadi.
Selama reaksi yang dikatalisis, enzim dan substrat berinteraksi untuk menghasilkan produk baru. Sementara enzim tetap tidak berubah setelah reaksi selesai, substrat sering dimodifikasi, kadang-kadang berubah sepenuhnya menjadi molekul atau molekul baru. Meskipun tetap tidak berubah, enzim memainkan peran utama dalam reaksi kimia yang terjadi karena menurunkan energi aktivasi agar reaksi dapat berlangsung. Ini berarti bahwa energi yang ada dalam interaksi kimia enzim dan substrat cukup untuk mengatasi rintangan energi reaksi.
Sepanjang reaksi, enzim dan substrat melewati tahapan yang berbeda. Beberapa di antaranya, yang dikenal sebagai tahap antara atau zat antara kimia, melibatkan pembentukan molekul transien baru. Enzim mampu menstabilkan ini dan mengkatalisis reaksi lebih lanjut untuk mengubah molekul-molekul ini menjadi produk yang diinginkan.
Keadaan transisi adalah kompleks lain yang terbentuk antara enzim dan substrat yang sangat berumur pendek dan berenergi tinggi. Mereka sering terjadi pada saat pemutusan ikatan, reformasi, atau penataan ulang dalam reaksi. Enzim sering disusun untuk mengurangi energi keadaan transisi melalui ikatan penstabil, dan seringkali pengurangan energi inilah yang menurunkan energi aktivasi reaksi.
Meskipun ada banyak pasangan substrat enzim, banyak enzim dapat berhubungan dengan banyak substrat. Faktanya, banyak enzim diperlukan untuk menggabungkan dua substrat menjadi satu molekul atau untuk memecah satu substrat menjadi dua molekul produk yang dihasilkan. Ada juga banyak enzim yang tidak spesifik, artinya mereka dapat menargetkan lebih dari satu substrat, tergantung pada kondisi di dalam sel.