Fosforyleringsnivån för organiska molekyler eller ämnen bestäms av två metoder: western blotting och masspektrometri. Fosforylering hänvisar oftast till bindningen av ett fosfat till protein. När fosfater fäster på proteiner, störs de naturliga processerna och funktionerna hos proteinenzymer i människokroppen. Att bestämma fosforyleringsnivån är avgörande för att behandla ett brett spektrum av sjukdomar, från cancer till diabetes.
Western blotting är en populär metod som används för att bestämma fosforyleringsnivån för en viss uppsättning proteiner. Antikroppar såsom anti-fosfo-tyrosin monoklonala antikroppar används vanligtvis eftersom de lätt binder till ett proteins tyrosinrester, som påverkas av fosforylering. I western blotting separeras proteinerna först efter storlek med hjälp av en elektrisk laddningsmetod som kallas gelelektrofores.
Proteinerna överförs sedan till ett membran som har täckts med speciella antikroppar som binder till fosfater på proteiner. När proteinerna väl har överförts kommer antikropparna att hålla fast vid alla proteiner med ett fosfat. Fosforyleringsnivån kan sedan bestämmas genom en röntgen av membranet. Alla påverkade proteiner kommer att avge en ljusblixt, vilket gör det lättare för forskaren att mäta fosforyleringsnivåer.
Masspektrometri är ett annat sätt att mäta fosforyleringsnivån för ett ämne. Denna process omvandlar proteinmolekylerna till joner, vilket gör dem lättare att spåra och mäta. Provet joniseras av en kraftfull jonkälla som översvämmer provet med elektroner. Denna åtgärd förvandlar provet till katjoner, positivt laddade joner.
Massanalysatorn på masspektrometern separerar jonerna genom deras massa och laddningsintensitet. Detta gör det möjligt för forskaren att upptäcka förhållandet mellan massa och laddning, vilket är avgörande för att upptäcka fosforyleringsnivån hos provet. Slutligen mäter detektorn jonerna i ordning så att data kan visas i diagramform. Diagrammet visar förhållandet mellan massa och laddning för jonerna på x-axeln och den relativa intensiteten för jonerna på y-axeln.
Fosforyleringsnivåer kan också mätas under substratfosforylering. Substratfosforylering är en process som skapar adenosintrifosfat (ATP), en molekyl som är avgörande för energiöverföring mellan celler, under glykolys. Denna process sker i både djurceller och växtceller.
I växtceller skapas ATP-molekyler genom att använda energi från solen. Denna energi sporrar fosforylering i växtens kloroplaster, platsen för växternas fotosyntes. Nivån av fosforylering korrelerar med mängden fosfat som behövs för att skapa ytterligare ATP-molekyler.