Vad är en spektrofotometer?

En spektrofotometer är ett av de vetenskapliga instrument som vanligtvis finns i många forsknings- och industrilaboratorier. Spektrofotometrar används för forskning inom fysik, molekylärbiologi, kemi och biokemi. Typiskt hänvisar namnet till Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy.
Ljusets energi är beroende av dess våglängd, vanligtvis betecknad som lambda. Även om det elektromagnetiska spektrumet sträcker sig över ett enormt intervall av våglängder, kan de flesta laboratorier bara mäta en liten bråkdel av dem. UV-Vis-spektroskopi mäter mellan 200 och 400 nanometer (nm) för UV-ljusmätningar och upp till cirka 750 nm i det synliga spektrumet.

För UV-Vis-spektroskopi är prover vanligtvis inneslutna och uppmätta i små behållare som kallas kyvetter. Dessa kan vara av plast om de används i det synliga spektrumet, men måste vara kvarts eller smält kiseldioxid om de används för UV-mätningar. Det finns vissa maskiner som kan använda glasprovrör.

Synlig spektroskopi används ofta industriellt för kolorimetri. Med denna metod mäts prover vid flera våglängder från 400-700 nm, och deras absorbansprofiler jämförs med en standard. Denna teknik används ofta av textil- och bläcktillverkare. Andra kommersiella användare av UV-Vis Spectroscopy inkluderar kriminaltekniska laboratorier och skrivare.

Inom biologisk och kemisk forskning kvantifieras lösningar ofta genom att mäta deras grad av ljusabsorption vid en viss våglängd. Ett värde som kallas extinktionskoefficienten används för att beräkna koncentrationen av föreningen. Till exempel använder molekylärbiologiska laboratorier spektrofotometrar för att mäta koncentrationerna av DNA- eller RNA-prover. De har ibland en avancerad maskin som kallas NanoDrop™ spektrofotometer som använder en bråkdel av mängden prov jämfört med den som används av traditionella spektrofotometrar.

För att kvantifieringen ska vara giltig måste provet följa Beer-Lambert-lagen. Detta kräver att absorbansen är direkt proportionell mot kyvettens väglängd och absorptionen av föreningen. Det finns tabeller över extinktionskoefficienter tillgängliga för många, men inte alla, föreningar.

Många kemiska och enzymatiska reaktioner ändrar färg över tiden, och spektrofotometrar är mycket användbara för att mäta dessa förändringar. Till exempel oxiderar polyfenoloxidasenzymer som gör att frukt brunnar lösningar av fenolföreningar och ändrar klara lösningar till sådana som är synligt färgade. Sådana reaktioner kan analyseras genom att mäta ökningen i absorbans när färgen ändras. Helst kommer förändringshastigheten att vara linjär, och man kan beräkna hastigheter från dessa data. En mer avancerad spektrofotometer kommer att ha en temperaturkontrollerad kyvetthållare för att utföra reaktionerna vid en exakt temperatur som är idealisk för enzymet.

Mikrobiologiska och molekylärbiologiska laboratorier använder ofta en spektrofotometer för att mäta tillväxten av bakteriekulturer. DNA-kloningsexperiment görs ofta i bakterier, och forskare måste mäta odlingens tillväxtstadium för att veta när de ska utföra vissa procedurer. De mäter absorbansen, som är känd som den optiska densiteten (OD), på en spektrofotometer. Man kan se från OD om bakterierna aktivt delar sig eller om de börjar dö.

Spektrofotometrar använder en ljuskälla för att lysa en rad våglängder genom en monokromator. Denna enhet sänder sedan ett smalt band av ljus och spektrofotometern jämför ljusintensiteten som passerar genom provet med den som passerar genom en referensförening. Till exempel, om en förening är löst i etanol, skulle referensen vara etanol. Resultatet visas som graden av absorbans av skillnaden mellan dem. Detta indikerar absorbansen av provföreningen.
Anledningen till denna absorbans är att både ultraviolett och synligt ljus har tillräckligt med energi för att excitera kemikalierna till högre energinivåer. Denna excitation resulterar i en högre våglängd, vilket är synligt när absorbansen plottas mot våglängden. Olika molekyler eller oorganiska föreningar absorberar energi vid olika våglängder. De med maximal absorption i det synliga området ses som färgade av det mänskliga ögat.

Lösningar av föreningar kan vara klara, men absorberas i UV-området. Sådana föreningar har vanligtvis dubbelbindningar eller aromatiska ringar. Ibland finns det en eller flera detekterbara toppar när absorptionsgraden plottas mot våglängden. Om så är fallet kan detta hjälpa till att identifiera vissa föreningar genom att jämföra formen på diagrammet med det för kända referensdiagram.
Det finns två typer av UV-Vis spektrofotometermaskiner, enkelstråle och dubbelstråle. Dessa skiljer sig åt i hur de mäter ljusintensiteten mellan referens- och testprovet. Dubbelstrålemaskiner mäter referens- och testföreningen samtidigt, medan enkelstrålemaskiner mäter före och efter att testföreningen tillsätts.