Ada ratusan metode yang berbeda untuk penentuan konsentrasi protein. Keragaman yang luar biasa dalam jenis larutan protein yang dianalisis oleh ahli biokimia adalah mengapa tidak ada metode universal tunggal yang bekerja untuk setiap jenis larutan protein. Uji protein yang paling umum adalah uji Bradford, uji Lowry dan uji asam bicinchoninic. Namun demikian, berbagai variasi telah dikembangkan sesuai kebutuhan untuk mengatasi kemungkinan ketidakcocokan kimia antara larutan protein dan reagen yang digunakan dalam pengujian.
Secara umum, ada dua kategori utama pengujian untuk penentuan konsentrasi protein. Pada metode kelompok pertama, pewarna warna-warni atau fluoresen ditambahkan ke larutan protein, dan itu mengikat secara khusus pada protein. Zat warna terikat memiliki panjang gelombang serapan unik yang sebanding dengan jumlah protein. Dengan menggunakan spektrometer, menjadi mungkin untuk memperkirakan konsentrasi protein.
Kelompok pengujian kedua melibatkan penambahan ion tembaga(II) ke dalam larutan protein, di mana ion ini direduksi menjadi ion tembaga(I). Ion tereduksi ini kemudian dapat membentuk kompleks warna-warni dengan mengikat protein. Dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang yang unik, konsentrasi protein juga dapat disimpulkan.
Salah satu metode penentuan konsentrasi protein yang paling populer adalah uji Bradford. Dalam pengujian ini, pewarna merah yang disebut coomassie brilian biru ditambahkan ke larutan protein di bawah kondisi asam. Saat pewarna ini berikatan dengan protein, ia membentuk kompleks biru permanen dengan absorbansi karakteristik pada 595 nanometer.
Terlepas dari keserbagunaan umum uji Bradford, itu tidak sesuai dengan beberapa larutan protein. Secara khusus, uji Bradford terganggu oleh adanya natrium dodesil sulfat (SDS), deterjen yang biasanya digunakan untuk memurnikan protein dan memecah sel dengan lisis. Deterjen ini mengganggu pengikatan pewarna ke protein, yang menghasilkan pembacaan penyerapan yang tidak dapat diandalkan dan tidak akurat. Jenis metode lain, kemudian, harus digunakan ketika SDS hadir.
Serangkaian uji protein lainnya telah dikembangkan, dan semuanya melibatkan variasi uji Biuret. Dalam reaksi ini, protein digabungkan dengan basa berair dan ion tembaga(II). Ion-ion ini direduksi dan kemudian dikelat oleh protein untuk membentuk kompleks warna-warni. Dua uji yang menggunakan uji ini adalah uji Lowry dan uji asam bicinchoninic.
Dengan uji Lowry, reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan ke uji Biuret. Reagen Folin-Ciocalteu mengoksidasi residu aromatik, terutama triptofan, dan membantu kompleks menyerap kuat pada 750 nanometer. Uji asam bicinchoninic, di sisi lain, melibatkan penambahan asam bicinchoninic ke uji Biuret. Setelah inkubasi singkat pada suhu sekitar 104° Fahrenheit (40° Celcius), dua ekuivalen asam dan ikatan peptida dari protein mengkelat satu ion tembaga(I). Hasilnya adalah kompleks yang menyerap kuat pada 562 nanometer.
Ketika memilih metode untuk penentuan konsentrasi protein, penting bagi seseorang untuk mempertimbangkan berbagai gugus fungsi kimia yang ada dalam larutan. Adanya rantai samping asam amino tertentu, ikatan disulfida dan kofaktor dapat membuat penentuan konsentrasi protein menjadi sangat tidak akurat. Seringkali perlu bagi seseorang untuk mempertimbangkan tidak hanya protein tetapi juga reagen dan buffer lain, seperti zat pereduksi dan deterjen. Metode yang ideal akan kompatibel secara kimiawi serta dapat diandalkan, murah, dan mudah disiapkan.