Protokol Western blot adalah standar yang tepat dimana tes imunoblot dilakukan. Western blot digunakan untuk mendeteksi protein dalam sampel jaringan. Proses memisahkan protein asli dengan menentukan panjang polipeptida menggunakan elektroforesis gel. Protein itu sendiri kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa dan diperiksa oleh antibodi.
Bagian pertama dari protokol western blot dimulai dengan pengumpulan jaringan. Sampel ini dikumpulkan baik dari jaringan hidup atau dari kultur sel. Jaringan dipecah dan berbagai inhibitor seperti protease atau fosfatase diperkenalkan untuk mencegah enzim melakukan pencernaan. Bagian dari protokol ini biasanya ditangani dalam suhu dingin untuk mengawetkan jaringan.
Proses elektroforesis gel adalah langkah selanjutnya dalam protokol western blot. Di bagian ini, protein diidentifikasi oleh berbagai faktor seperti berat molekul atau muatan listrik. Proses ini paling sering diselesaikan dengan menggunakan gel poliakrilamida dengan buffer natrium dodesil sulfat. Pada dasarnya, protein menjadi bermuatan negatif dan bergerak menuju elektroda bermuatan positif di dalam gel.
Transfer protein adalah bagian selanjutnya dari proses western blot secara keseluruhan. Sebuah membran ditempatkan di atas gel, diikuti oleh kertas saring. Saat arus listrik diberikan, protein ditarik ke dalam membran. Ini disebut sebagai bagian “blotting” yang sebenarnya dari analisis. Membran sangat rapuh dan mudah rusak.
Alur yang benar dari protokol western blot memerlukan langkah yang dikenal sebagai binding. Untuk mencegah kontaminasi protein itu sendiri oleh antibodi yang perlu ditambahkan, semacam perisai perlu diterapkan. Jenis pemblokiran yang paling umum menggunakan susu kering tanpa lemak dan deterjen. Ini mengikat tempat terbuka di membran dan memungkinkan hasil yang lebih jelas ketika antibodi ditambahkan.
Deteksi adalah langkah selanjutnya sesuai dengan protokol yang benar. Protein diperkenalkan ke antibodi yang telah dikaitkan dengan enzim tertentu yang akan memberikan peneliti informasi yang diinginkan. Antibodi diinkubasi dengan membran selama 30 menit atau lebih. Setelah itu, membran dicuci dan antibodi sekunder diperkenalkan yang mengikat yang pertama. Seringkali, agen luminescent digunakan untuk membantu para ilmuwan dengan proses identifikasi.
Bahan dicuci lagi untuk menghilangkan barang-barang yang tidak terikat. Analisis ukuran pita bernoda mengungkapkan informasi mengenai keunggulan dan tingkat protein tertentu. Ini umumnya diselesaikan beberapa kali untuk memastikan analisis yang tepat. Pilihan untuk deteksi termasuk sinar-x, pewarna dan bahan kimia.